论文荐读
本文刊发于《分子植物育种》年17卷第1期。欢迎订阅杂志、投稿及刊登广告，联系-，E-mail:mpb
hibio.org。基于SSR标记的冬瓜种质资源遗传多样性分析
焦贤贤1,2 刘文睿2 江彪2 彭庆务2 刘政国1* 谢大森2*
1广西大学农学院,南宁,;2广东省农业科学院蔬菜研究所,广东省蔬菜新技术研究重点实验室,广州,
摘 要 为了加强冬瓜种质资源的保护和评价，明确资源间的亲缘关系，本研究利用SSR标记在分子水平上对份冬瓜种质资源进行遗传多样性分析。结果表明，19对SSR引物共扩增出条条带，其中多态性条带条，多态率92.86%；通过POPGENE1.31软件计算每对引物的平均有效等位基因数(Ne)为1.，平均Neis遗传多样性指数(He)为0.，平均Shannons信息指数(I)为0.。采用Jaccard相似系数进行种质间的聚类分析，在遗传距离为0.70的位置可将全部种质分为6个类群。通过聚类结果可知，种质材料未按照地理来源划分，但相同果型、籽型的种质资源间亲缘关系较近。本研究基于SSR标记分析冬瓜种质资源遗传多样性并进行亲缘关系的聚类，将为冬瓜种质的保存和利用提供理论依据。
关键词 冬瓜,遗传多样性,SSR标记
GeneticDiversityAnalysisofWaxGourdGermplasmResourcesBasedonSSRMarkersJiaoXianxian1,2 LiuWenrui2 JiangBiao2 PengQingwu2 LiuZhengguo1* XieDasen2*
1CollegeofAgriculture,GuangxiUniversity,Nanning,;2GuangdongKeyLaboratoryforNewTechnologyResearchofVegetables,VegetableResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,
AbstractInordertostrengthentheprotectionandevaluationofwaxgourdgermplasmresources,anddefinethekinshipbetweenresources,thisstudyanalyzedthegeneticdiversityofwaxgourdgermplasmresourcesatthemolecularlevelbySSRmarkers.Theresultsshowedthatbandswereamplifiedby19pairsofmarkers,ofwhichwerepolymorphic,withapolymorphismrateof92.86%.WhencalculatedbyPOPGENE1.31software,theaverageeffectiveallelenumber(Ne)ofeachpairprimerwas1..TheaverageNeisgeneticdiversityindex(He)was0.,andtheaverageshannonsinformationindex(I)was0..TheJaccardsimilaritycoefficientwasusedforclusteranalysisofthesegermplasm,andallthegermplasmweredividedinto6groupsatthegeneticdistanceof0.70.Accordingtotheclusteringresults,thegermplasmmaterialswerenotclassifiedaccordingtogeographicalorigin,howeverthegermplasmresourcesofthesamefruittypeandseedtypehadaclosegeneticrelationship.ThisstudyanalyzedthegeneticdiversityofwaxgourdgermplasmresourcesandclusteredgeneticrelationshipsbasedonSSRmarkers,whichwouldprovideatheoreticalbasisforthepreservationandutilizationofwaxgourdgermplasm.
KeywordsWaxgourd,Geneticdiversity,SSRmarker
冬瓜(BenincasahispidaCogn.)属于葫芦科(Cucurbitaceae)冬瓜属(Benincasasavi)，含有一个变种节瓜(B.hispida(Thunb.)Cogn.Var.chieh-quaHow)。冬瓜起源于中国南部和东印度，广泛分布于亚洲的热带、亚热带及温带地区，在中国已有两千多年的栽培历史(朱德蔚等,,农业出版社,pp.-)。冬瓜营养丰富，富含多种维生素及膳食纤维，兼具药用和保健功效，是健康的高钾低钠食品(张斌等,,中国食物与营养,(5):19-21)。冬瓜以果皮颜色可分为粉皮冬瓜、黑皮冬瓜(或青皮冬瓜)、黄皮冬瓜三类；以果实大小可分为小果型(2kg以下)、中果型(2~10kg)和大果型(10kg以上)；按种子类型可分为有棱扁籽(或双边籽)和无棱光籽(或单边籽)。近年来随着育种者对品种的人为选择以及商品种的推广普及，地方品种的数量在不断减少，有些资源甚至已经消失，造成育种基础群体遗传背景日趋狭窄，品种间遗传相似系数上升。因此，加强现有种质资源的保护和评价，明确资源间的亲缘关系，对于冬瓜生物多样性保护、种质资源创新、杂交育种及基因挖掘都具有重要意义。
目前，国内外研究者主要采用RAPD和ISSR两种类型的分子标记进行冬瓜、节瓜遗传多样性分析(Vermaetal.,;Pandeyetal.,;张建军等,;宋世威等,;江彪等,;王鹏等,;朱冬冬等,)，虽然这两类标记有一定的实用性，但稳定差、随机性强。Verma等()采用RAPD对冬瓜进行分析标记的多态性比率仅为46%；Pandey等()采用RAPD对34份冬瓜种质进行分子标记的多态性比率为73%；宋世威等()采用RAPD对41份冬瓜、节瓜种质进行分子标记的多态性比率为56.6%；江彪等()采用ISSR对冬瓜属57份种质进行分子标记的多态性比率为68.0%；王鹏等()利用ISSR分子标记对节瓜自交系进行遗传多样性分析的多态性比例为59.21%，可见多态性比率均不高。近年来随着测序技术的快速发展，根据冬瓜测序信息开发了大量的特异SSR标记(Jiangetal.,)，这些标记具有分辨率高、稳定性好等特点。本研究基于SSR标记分析冬瓜种质资源遗传多样性并进行亲缘关系的聚类，将为冬瓜种质的保存和利用提供理论基础。
1结果与分析
1.1冬瓜种质资源基因组DNA的质量检测
本实验所提取的DNA经NanoDrop(核酸蛋白分析仪)检测，数据显示份种质资源的DNA的OD/OD值均在1.8~2.0之间，原液浓度均在ng/μL以上，达到了本实验所要求的DNA纯度要求。
1.2SSR标记的筛选及遗传多样性分析
选取6份不同地理来源且表型差异显著的冬瓜种质对对SSR引物进行多态性筛选。在对基因组SSR引物中，有对具有多态性，多态性比率为31.3%。从对具有多态性的引物中挑选出35对扩增条带清晰、多态性好的引物对群体材料进行SSR扩增，其中19对引物(表1)在群体材料中经过SSR扩增、PAGE、染色、显色后表现为多态性好且条带清晰。
19对引物共扩增出条条带，其中多态性条带为条，多态率为92.86%，每对引物平均扩增条带数为9.6条。每对引物扩增结果显示，不同引物扩增位点数在6~15之间，其中引物9c扩增条带数为15条，是所有引物中扩增条带数最多的，引物3c扩增条带数最少，仅有6条。多态性条带比例差异亦较大，其中9对(占总数47.37%)引物的多态率达到了%，引物10c的多态性比例最低，仅有55.56%(图1;表2)。利用POPGENE1.31软件计算冬瓜种质资源扩增位点的有效等位基因数(Ne)、Neis遗传多样性指数(He)和Shannons信息指数(I)。结果表明，份种质平均有效等位基因数(Ne)为1.，平均Neis遗传多样性指数(He)为0.，平均Shannons信息指数(I)为0.。不同位点的遗传多样性程度差异较大，Ne的最大值和最小值分别为1.和1.，He的最大值为0.，最小值仅为0.，I值最大为0.，最小为0.，表明供试的冬瓜材料间存在着较为丰富的遗传多样性。
图1引物SSR-9c对部分冬瓜供试材料的扩增
注:M:DLDNAMarker;S1~S48:引物9c对48份冬瓜材料的SSR-PCR扩增情况
Figure1ThePCRamplificationofSSR-9cprimertopartofwaxgourdmaterialsusedinthestudy
Note:M:DLDNAMarker;S1~S48:TheSSR-PCRamplificationof9cprimerto48waxgourds
1.3份冬瓜种质的遗传多样性分析及聚类
利用DPSV16.05软件及Jaccard相似系数进行种质间的非加权组平均法(UPGMA)聚类分析。结果表明，份冬瓜种质资源遗传距离介于0.~0.之间，平均遗传距离为0.，在遗传距离为0.的位置可将全部种质分为6个类群。第Ⅰ类群仅有来源于马来西亚的1份材料，为中小果型的粉皮冬瓜，种子类型为有棱扁籽。第Ⅱ类群包括23份种质，来源于云南、广西、泰国、新西兰、日本以及EMS诱变的创新材料，该类群种质的果型以小果型为主、种子类型以有棱扁籽为主。第Ⅲ类群有5份种质，分别来自广东、湖南。在表型上没有一定的规律性，果型包括大、中、小三种果型；果皮分为粉皮、黑皮和黄皮三种类型；种型也兼具有棱扁籽和无棱光籽两种类型。第Ⅳ类群是种质最多的一大类群，有54份材料，其中包含了全部17份供试节瓜材料的76%(13份)，该类群除一份资源来源于越南外，其余均来源于中国的云南、广西、广东、海南、福建、江苏、上海、台湾等地，这一类群以小果型、粉皮、有棱扁籽种型为主。第Ⅴ类群包含25份种质资源，主要来源于广东，该类群种质大部分为大果型的黑皮冬瓜材料，种型多为无棱光籽。第Ⅵ类群有3份种质，其中2份来源于广东，另一份来源于日本，均为小果型的粉皮冬瓜，种型均为有棱扁籽(图2)。以上结果表明，供试的冬瓜种质资源聚类未按照地理来源划分，但与果型大小及种子类型相关，相同果型和籽型的材料往往被聚为一类。其中小果型、有棱扁籽类型的种质遗传多样性较高。
图2份冬瓜种质资源UPGMA法聚类分析
Figure2TheUPGMAclusteranalysisofwaxgourdgermplasmsresources
2讨论
不同种质资源间形态、生理生化特征的区别，归根到底是核酸水平上的差异。利用分子标记进行种质资源间的遗传多样性研究，能弥补只利用农艺性状来鉴别品种间亲缘关系的主观性，并避免环境的影响。SSR标记是基于测序信息开发的特异性标记，较随机引物具有更好的多态性、重复性和稳定性。本研究中筛选出19对冬瓜SSR引物，共扩增出条条带，其中多态性条带条，多态率达到92.86%，显著高于利用RAPD(宋世威等,)和ISSR(江彪等,)标记进行冬瓜遗传多样性分析的多态率，说明SSR标记能够更高效地对冬瓜种质进行聚类分析。
供试的份冬瓜、节瓜种质资源被分为6大类群，通过聚类结果可知，冬瓜、节瓜种质资源亲缘关系受地理来源影响不大，但与果型大小、种子类型及果皮颜色具有一定的相关性，相同果型、籽型和皮色的种质更趋于聚为一类。导致这一结果的原因可能是用于聚类分析的SSR标记与上述果实性状具有一定的相关性。参试的节瓜种质资源没有被单独的聚为一类，而是和冬瓜资源混合分散在各类群中，说明节瓜和冬瓜的亲缘关系较为紧密，节瓜只是冬瓜的一个变种，这与孟祥栋等()、宋世威等()以及乔燕春等()的研究结果一致。小果型、有棱扁籽类型的种质占据了6大类群的第Ⅰ、第Ⅱ、第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅵ类群，可见小果型、有棱扁籽类型的种质遗传多样性较高。
综上所述，SSR标记技术可有效地应用于冬瓜种质资源遗传多样性分析及聚类研究，冬瓜种质间亲缘关系与地理来源关系不大，果实性状相似更容易被聚为一类。种质聚类结果可为冬瓜种质资源高效利用和亲本选配提供理论指导。
3材料与方法
3.1试验材料
供试的份冬瓜种质资源(冬瓜94份,节瓜17份)来源于中国(广东,广西,云南,四川,湖南,江西,江苏,上海,福建,台湾等地区)、越南、马来西亚、泰国、新西兰、日本等国以及课题组通过辐射诱变、EMS诱变等方法获得的创新材料(表3)。
3.2冬瓜基因组DNA提取和浓度测定
将催好芽的供试材料播种于广东省农业科学院白云基地保温棚的育苗盘中进行育苗，两到三片真叶时定植到大田，四片真叶以上时，单株取一到两片真叶，保存于-80℃冰箱中，后置于研钵中用液氮进行研磨，采用改良CTAB法(郭凌飞等,;谢大森等,;安重莹等,)提取冬瓜基因组DNA，用NanoDrop(核酸蛋白分析仪)检测DNA的质量与浓度，稀释至使用浓度50ng/μL，保存于-20℃冰箱中。然后用1%的琼脂糖凝胶电泳进一步检测所提取DNA的质量，用GBox凝胶成像系统观察结果。
3.3多态性SSR引物的筛选
试验所用引物均为根据冬瓜基因组序列信息开发的特异SSR引物。扩增产物经过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以V的电压电泳90min，然后用银染法进行染色和显色，最后在灯箱上观察并拍照。
先选取6份不同地理来源且表型差异显著的冬瓜种质对对SSR引物进行多态性筛选，再用从对基因组SSR引物中筛选出的35对扩增条带清晰、多态性好的引物对份群体材料进行SSR扩增，最后选出19对扩增结果较好的进行数据统计并进行数据分析。
PCR反应的总体系为20μL，含有10×TaqBuffer(含20mmol/LMg2+)2.0μL；dNTPs(10mmol/L)0.4μL；上、下游引物各1μL；TaqPolymerase(2U)0.5μL；DNA模板1μL(50ng/μL)，ddH2O补至20μL。Taq酶和dNTPs购自广州鼎国生物有限公司，引物合成于上海生工生物有限公司。PCR扩增程序为95℃预变性3min；94℃变性45s，68℃复性1min(每个循环退火温度降低2℃)，共6个循环，72℃延伸1min；94℃变性30s，58℃复性1min(每个循环退火温度降低1℃)，共8个循环，72℃延伸1min；94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。扩增产物采用8%非变性PAGE凝胶进行检测。
3.4数据统计方法
将8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上清晰且可重复出现的条带统计为“1”，同一位置未出现的条带统计为“0”，生成由数字“1”和“0”组成的原始矩阵。利用POPGENE1.31软件计算冬瓜种质资源扩增位点的遗传参数。用DPSV16.05软件及Jaccard相似系数进行种质间的非加权组平均法(UPGMA)聚类分析。
作者贡献
焦贤贤负责数据分析和论文的写作；刘政国和谢大森精心指导并为文章修改和完善提供宝贵意见；刘文睿负责试验设计和部分试验分析工作；江彪完成部分田间工作；彭庆务负责提供节瓜种质资源。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目()、广东省科技计划项目(B020234)、广东特支计划项目(TQ03N)和广州市珠江科技新星专项(206030)共同资助。
参考文献
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本文引用格式
JiaoX.X.,LiuW.R.,JiangB.,PengQ.W.,LiuZ.G.,andXieD.S.,,GeneticdiversityanalysisofwaxgourdgermplasmresourcesbasedonSSRmarkers,FenziZhiwuYuzhong(MolecularPlantBreeding),17(1):-(焦贤贤,刘文睿,江彪,彭庆务,刘政国,谢大森,,基于SSR标记的冬瓜种质资源遗传多样性分析,分子植物育种,17(1):-)
END
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